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二氧化硅室温磷光纳米材料的制备及其细胞成像应用
来源:一起赢论文网     日期:2015-03-09     浏览数:3633     【 字体:

  摘 要 利用溶胶- 凝胶法制备了非金属掺杂的二氧化硅室温磷光纳米材料, 探讨了这种纳米材料的可控制备、 光谱性质、 细胞毒性和细胞成像。通过 TEM 和 XRD 对此材料的形貌和结构进行表征。结果表明, 所制备材料为二氧化硅非晶材料, 粒径约为 50 nm。通过荧光分光光度计对此材料的荧光和磷光光谱进行表征, 结果表明, 此材料最大激发峰处于 280 nm, 最大荧光发射峰处于 335 nm, 最大磷光发射峰处于 440 nm。此材料还具有良好的环境稳定性,在空气中放置 3 个月, 其磷光强度基本不发生变化, 表明其具有良好的长期稳定性。MTT 及激光共聚焦显微成像分析结果表明, 此材料具有良好的生物相容性且可顺利进入细胞, 并定位在溶酶体, 因此有望作为新型溶酶体纳米探针在生物医学领域得以广泛应用。

关键词 二氧化硅; 溶胶- 凝胶法; 室温磷光; 细胞毒性; 细胞成像
    1 引 言
    二氧化硅廉价易得, 且具有良好的化学稳定性、 热稳定性、 绝缘性, 因此常作为发光材料的掺杂基质[1~3 ] 。此外, 二氧化硅还具有良好生物亲和性并且表面容易修饰, 利用二氧化硅作为基质或包裹材料制备的发光纳米复合材料如染料掺杂的二氧化硅纳米颗粒或二氧化硅包裹的量子点等在细胞成像研究中得到了广泛应用 [4~8 ] 。然而此方法通常较为繁琐、 费时, 且存在染料泄露、 潜在毒性等方面的问题。1997 年 Green 等[9 ] 报道了非金属白色磷光体, 表明利用二氧化硅结构中的碳杂质缺陷可制备发光性能优异的无金属掺杂的二氧化硅室温磷光材料。最近, Zhao 等[10 ] 基于二氧化硅结构中的碳杂质缺陷制备了二氧化硅的介孔室温磷光纳米材料。本研究在此基础上利用简单的溶胶- 凝胶法合成了无金属掺杂的二氧化硅室温磷光纳米材料, 优化了制备条件, 初步研究其光致发光现象及材料的细胞毒性。结果表明, 此材料不仅具有良好的生物相容性, 而且还具有良好的环境稳定性和长期稳定性, 可用于长期的活细胞成像研究。与基于染料或量子点的二氧化硅复合纳米材料相比, 此材料具有制备简单、 不存在染料泄露、 低毒等优点, 因此有望作为潜在的细胞标志物在细胞成像中得以应用。
    2 实验部分
    2.1 仪器与试剂F- 7000 荧光分光光度计(日本 Hitachi 公司);SX2- 4- 13 马弗炉(上海跃进医疗器械厂);S22- 2 磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司);JEL- 2010F 透射电子显微镜(JEOL 公司);粉末 X 射线衍射仪(PANalyticalX'Pert Pro);Infinite M200 酶标仪(瑞士 Tecan 公司);TCS- SP5 激光共聚焦显微镜(德国 Leica 公司)。正硅酸乙酯、 柠檬酸钠(阿拉丁试剂(上海)有限公司);二甲基亚砜(DMSO) 和异丙醇(国药集团化学试剂有限公司);噻唑蓝溴化四唑(MTT,M5655, 美国 Sigma- Aldrich 公司)。RPML- 1640 培养基和胎牛血清 (FBS, 美国 Life Technology 公司)。NCI- H446 细胞(美国菌种保藏中心(ATCC))。LysoTrackerRed(Invitrogen 公司)。其它试剂均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司, 所用试剂在使用前均未作进一步的纯化处理, 实验用水均为二次蒸馏水。
    2.2 非金属掺杂二氧化硅的室温磷光材料的制备在 25 mL 异丙醇中加入 5 mL 适当浓度的柠檬酸钠溶液, 搅拌1 h, 柠檬酸钠充分分散在异丙醇溶剂中, 加入 25 mL TEOS 溶液, 继续搅拌 2 h 后, 逐滴加入 1.0 mL 浓氨水, 持续搅拌 12 h 后停止搅拌, 室温陈化 12 h, 然后在马弗炉煅烧获得最终样品。所得样品研磨后直接用于 TEM、 XRD 及光谱测试。
    2.3 细胞毒性测试毒性实验采用 MTT 方法检测。将肺癌患者细胞(NCI- H446)悬液以每孔 90 μL(10000 个)细胞的密度接种到 96 孔平底培养板中, 5% CO 2 , 37 ℃孵育, 至细胞单层铺满孔底。将制备的二氧化硅纳米材料分散在 DMSO 溶剂中获得不同浓度的悬浊液样品。移取 10 μL 加入 96 孔培养板各孔中, 使各孔样品的终浓度分别为 100,50,10,1 和 0.1 μg/mL (每个浓度设 6 个复孔), 与细胞共同孵育 24 和 48 h。每孔加入 20 μL MTT 溶液(5 mg/mL, 即0.5% MTT), 继续培养4 h。终止培养, 吸弃上清液, 每孔加150 μLDMSO, 避光振荡 10 min, 使甲臜( MTT 液被酶还原后产生的蓝色结晶物质) 充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD 490 nm(630 nm 为参考波长)处测量各孔的吸光值。以实验组平均吸光度与空白对照组平均吸光度的百分比计算细胞存活率, 以上操作均平行操作 3 次。
    2.4 细胞成像实验NCI- H446 cells (1×10 5 ) 接种到直径为 20 mm 的玻璃底细胞培养皿中(NEST 公司), 用 DMEM 培养基培养 14 h, 待细胞贴壁后, 加入分散在 DMSO 中的二氧化硅悬浊液样品, 使其终浓度为 10 μg/mL,继续孵育 24 h。去除细胞培养液, 加入 2 mL 新鲜的细胞培养液及 1 μL LysoTracker Red 染色工作液(溶酶体红色荧光探针,Invitrogen)混匀, 使其终浓度为 50 nmol/L, 与细胞 37 ℃共孵育 30 min。去除LysoTracker Red 染色工作液, 用 PBS 缓冲溶液(pH 7.4)清洗细胞 3 次后, 加入 2 mL DMEM 培养基, 在激光共聚焦显微镜下观察细胞成像,其中 LysoTracker Red 检测时的最大激发波长为 577 nm, 最大发射波长为 590 nm。
    3 结果与讨论
    3.1 二氧化硅室温磷光纳米材料的制备Green 等[9 ] 用溶胶凝胶方法制备了二氧化硅磷光体, 并研究了不同有机酸及二氧化硅前驱体对该磷光体发光性能的影响。本研究在此基础上, 以 TEOS 为二氧化硅前驱体、 异丙醇为溶剂在柠檬酸钠存在下制备了二氧化硅室温磷光纳米材料, 此材料在紫外光激发下会产生荧光和磷光的发光现象, 但是其发光强度会受到制备过程中柠檬酸钠浓度和煅烧温度的影响, 因此, 考察了柠檬酸浓度及煅烧温度对此材料的影响, 结果如图 1A 所示。随着柠檬酸钠浓度升高, 所制得材料的发光强度先升高后降低, 当柠檬酸浓度为0.035 mol/L 时, 其发光强度最大。固定柠檬酸浓度为0.035 mol/L 时, 将用溶胶凝胶法制备的样品在不同温度下煅烧, 其结果如图1B 所示, 当煅烧温度为650 ℃, 煅烧时间为1 h, 所制得材料的发光强度最强。因此, 本研究选择柠檬酸的浓度为 0.035 mol/L, 用溶胶凝胶法制备二氧化硅磷光纳米材料, 在 650 ℃下煅烧 1 h。
    3.2 二氧化硅室温磷光纳米材料的结构和组成表征采用 TEM 对所合成材料的形貌和尺寸进行表征, 结果如图 2A 所示, 表明此材料粒径约为 50 nm;EDS 光谱表明, 此材料除了 Si,C,O 之外, 无其它元素存在, 而在 XRD 图谱(图 2C)中仅在 23 o 附近出现一个晶胞衍射峰, 进一步表明此材料为二氧化硅的无定形纳米材料。
    3.3 二氧化硅室温磷光纳米材料的光谱表征所制备的二氧化硅样品在紫外光激发下发出白光, 且移去激发光后其发光逐渐熄灭, 可见所制备的材料不仅可发射荧光,还可发射磷光。因此, 本研究用荧光分光光度计考察了此材料的荧光及磷光光谱, 结果如图 3 所示, 最大荧光激发波长和发射波长分别在 280 和 335 nm;最大磷光激发波长和发射波长分别在 280 和 440 nm, 与先前报道的二氧化硅磷光体接近 [9, 10 ] 。此发光强度随着煅烧温度的提高而显著降低。可以认为,此材料的光致发光现象也是由于煅烧过程在二氧化硅结构中产生了碳杂质缺陷所致。近年来, 基于二氧化硅的杂质缺陷制备出了多种二氧化硅的磷光体, 如 TiO 2 /SiO 2 [11, 12 ] ,ZnO/SiO 2 [13 ] 和 PbO/SiO 2 [14 ] 室温磷光纳米材料, 并且基于 TiO 2 /SiO 2 纳米材料的磷光会被 H 2 O 2 猝灭,ZnO/SiO 2 和 PbO/SiO 2 纳米材料的磷光会被 S 2 猝灭, 构建了 H 2 O 2 及 S 2 的可视化室温磷光传感器。然而, 本研究制备的二氧化硅室温磷光纳米材料具有良好的环境稳定性, 其室温磷光及荧光的发光强度不会被有机溶剂(如乙醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 石油醚等)猝灭。将此材料分散在 1 mol/L 含有如下离子(Na + ,K + ,Cd2+,Zn2+,NH +4 ,Ca2+,Al3+,Cl ,PO 24,Ac ,Br ,SO 24,CO 23,NO 3 )或 H 2 O 2 溶液中, 其磷光强度也基本不发生改变, 如图 4 所示。其中在图 4 标注* 的磷光强度为相应离子与二氧化硅室温磷光纳米材料反应 3 h 后, 经去离子水清洗, 除去相应离子后, 得到的磷光强度。Na 2 S 饱和溶液、 1 mol/L的 NaNO 2 或 Na 2 S 2 O 3 溶液与二氧化硅室温磷光纳米材料混合后, 会使此材料的磷光强度明显下降, 但经过去离子水清洗后, 其磷光强度恢复, 可能是由于这些物质吸附在材料表面, 影响了材料的激发或发射光强度。此外, 此材料在空气中放置 3 个月,其磷光及荧光强度基本不变, 表明此材料具有良好的长期稳定性。此二氧化硅室温磷光纳米材料的良好环境稳定性及长期稳定性为其作为纳米探针在细胞成像方面的应用提供了极大可能性。
    3.4 细胞毒性研究将所制备的二氧化硅室温磷光纳米材料用于细胞成像分析: 首先用 MTT 法考察了此材料的细胞毒性。将所制备的二氧化硅室温磷光纳米材料分散在 DMSO 溶剂中配制成不同浓度的悬浊液, 加入到人小细胞肺癌细胞(NCI- H446) 中, 使样品的最终浓度分别为100,50,10,1.0 和 0.1 mg/L, 共同孵育 24 及48 h, 用 MTT 法考察二氧化硅室温磷光纳米材料对人小细胞肺癌细胞活性的影响。结果如图 5A 所示, 在实验浓度范围内将二氧化硅室温磷光纳米材料与细胞共同孵育 48 h 后, 其细胞存活率仍大于 90%, 并且随着纳米粒子浓度的增大, 细胞的存活率改变不大, 表明此材料的细胞毒性较低。细胞形态的表征进一步确认了此材料的低毒性。如图 5B 所示, 将二氧化硅室温磷光纳米材料与 NCI- H446 细胞共同孵育 48 h 后,细胞形态并未发生明显变化, 这说明在此浓度条件下, 二氧化硅室温磷光纳米材料对细胞没有毒性, 不会影响细胞正常的生命活动, 也表明此材料具有良好的生物相容性。
    3.5 活细胞成像分析将二氧化硅室温磷光纳米材料与 NCI- H446 共同孵育 24 h 后, 用激光共聚焦显微镜对此材料进行示踪成像研究, 结果如图 6 所示。在入射光(λ =405 nm)的激发下,在细胞中观察到了二氧化硅室温磷光纳米材料的光致发光信号(图 6A 绿色部分), 表明此材料可进入细胞;并且此细胞中标为绿色的光致发光信号集中在细胞某一部位, 表明此材料被细胞吞噬后可能在某一细胞器中聚集。溶酶体是细胞对大颗粒物质的消化场所, 猜测二氧化硅室温磷光纳米材料进入细胞后可能处于溶酶体位置, 因此将标记了二氧化硅纳米材料的细胞与溶酶体探针 LysoTracker Red 共同孵育后, 用激光共聚焦显微镜观察同一细胞中两种染料的位置, 结果如图 6B 和 6C 所示。细胞与 LysoTracker Red 染料共孵育后, 在光激发下将在溶酶体观察到光致发光信号(图 6B 中红色部分), 此信号(标为红色)与标为绿色的二氧化硅纳米材料产生的光致发光信号叠加后为橙色(图 6C), 表明两种发光信号的位置几乎一致, 证实了此二氧化硅室温磷光纳米材料不仅可进入细胞,且定位于溶酶体。
    4 结 论
本研究利用溶胶凝胶法制备了具有良好生物相容性的二氧化硅室温磷光纳米材料。此材料在紫外光的激发下可发射荧光和磷光;并且此材料的光致发光现象还具有良好的环境稳定性及长期稳定性, 可用于细胞成像研究;此材料进入细胞后主要在溶酶体聚集, 因此有望作为一种新型溶酶体探针应用于生物医学领域。
    References1 Geng J,Liu J,Liang J,Shi H,Liu B. Nanoscale,2013,5: 8593-86012 Vaccaro L,Morana A,Radzig V,Cannas M. J. Phys. Chem. C,2011,115: 19476-194813 Zhong Y,Peng F,Bao F,Wang S,Ji X,Yang L,Su Y,Lee S- T,He Y. J. Am. Chem. Soc.,2013,135(22): 8350-83564 Hao X,Zhou M,Zhang X,Yu J,Jie J,Yu C,Zhang X. Chem. Comm.,2014,50: 737-7395 Hong X,Wang Z,Yang J,Zheng Q,Zong S,Sheng Y,Zhu D,Tang C,Cui Y. Analyst,2012,137: 4140-41496 Veeranarayanan S,Poulose A C,Mohamed M S,Nagaoka Y,Iwai S,Nakagame Y,Kashiwada S,Yoshida Y,MaekawaT,Kumar D S. Int J Nanomedicine,2012,7: 3769-37867 WANG Xu,QI Wen- Xue,XIA Yan- Qing,TANG Bo. Chinese J. Anal. Chem.,2012,40(8): 1301-1308王 栩,齐文学,夏雁青,唐 波. 分析化学,2012,40(8): 1301-13088 Deng L,Liu L,Zhu C,Li D,Dong S. Chem. Commun,2013,49(25): 2503-25059 Green W H,Le K P,Grey J,Au T T,Sailor M J. Science,1997,276: 1826-182810 Zhao L,Ming T,Chen H,Gong L,Chen J,Wang J. Phys. Chem. Chem. Phys.,2011,13: 2387-239311 Shu X,Chen Y,Yuan H,Gao S,Xiao D. Anal. Chem.,2007,79(10): 3695-370212 Li Y,Liu XY,Yuan HY,Xiao D. Biosens. Bioelectron.,2009,24(12): 3706-371013 Wang N,Zhou T,Wang J,Yuan H,Xiao D. Analyst,2010,135: 2386-239314 Zhou T,Wang N,Li C,Yuan H,Xiao D. Anal. Chem.,2010,82(5): 1705-1711
 
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