使用快速蒸发电离质谱和电感耦合等离子体质谱法，将中级数据融合与多变量分析方法相结合，应用于双平台质谱数据集，以确定鲑鱼来源和生产方法的正确分类。该研究使用了来自五个不同地区的鲑鱼 （n = 522） 和两种生产方法。该方法实现了 100% 的交叉验证分类准确率，并且所有测试样本 （n = 17） 都正确确定了其来源，这在单平台方法中是不可能的。发现了 18 个稳健的脂质标志物和 9 个元素标志物，这为鲑鱼的来源提供了强有力的证据。因此，我们证明了我们的中级数据融合 - 多变量分析策略大大提高了正确识别鲑鱼地理来源和生产方法的能力，这种创新方法可以应用于许多其他食品真伪应用。

 

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介绍

全球鲑鱼消费量是 1980 年的三倍1.曾经被认为是美味佳肴的鱼现在是美国 （US） 最受欢迎的鱼类之一2， 欧洲 （EU）3和亚洲国家4.大西洋鲑鱼和太平洋鲑鱼是世界上鲑鱼的两大主要来源。近 70% 的鲑鱼产量是养殖的，2020 年，养殖鲑鱼产量超过 260 万吨，而野生鲑鱼的产量仅为约 550,000 吨1.鲑鱼价格可能会波动5但在过去 10 年中增长了一倍多，现在高于许多可比商品6.南北半球的大规模水产养殖用于生产大西洋鲑鱼，已成为西方世界最常见的养殖鱼类7,8.

 

主要的鲑鱼消费地区是欧盟，其次是美国、巴西、中国、俄罗斯和日本9.当对中国消费者进行询问时，发现质量和价值是购买三文鱼时最重要的因素。7% 的受访者认为阿拉斯加野生鲑鱼的味道优于养殖品种，这表明中国消费者对购买野生鲑鱼更感兴趣10.日本消费者享受着世界上最多样化的鲑鱼市场。该市场上鲑鱼的价格由所有鱼类的总供求关系决定11.一份报告显示，在一些北美地区，海鲜消费者更喜欢野生鲑鱼而不是养殖鲑鱼12.但是，他们可能无法收到他们支付的鲑鱼类型和质量。胡 等人13使用 DNA 条形码和 DNA 迷你条形码方法显示，温哥华鱼产品的错误标记率为 25%。一个主要问题是，鲑鱼可以从阿拉斯加的渔船运到中国的加工厂，然后运到纽约的零售店，而有关鱼的信息，如它的来源以及它是被捕捞的还是养殖的，在沿着这个最复杂的供应链运输时可能会丢失或被欺诈性地修改14.

 

在科学文献中，识别鱼贴错标签的措施在真伪研究领域很常见15.DNA 条形码用于识别大西洋鲑鱼与太平洋鲑鱼的市场替代16.最近，Deconinck 等人。17提出了一种微滴数字 PCR 方法，用于鉴定和定量加工和混合食品中大西洋鲑鱼的百分比，从而能够鉴定和半定量含有多个物种的加工食品中的鲑鱼特异性组织。近年来，质谱 （MS） 作为食品真伪研究中的一种工具越来越受欢迎。Fiorino 等人。18描述了一种用于野生型和养殖鲑鱼鉴别的实时直接分析 - 高分辨率质谱 （DART-HRMS） 方法。虽然以前的研究报道了鲑鱼真伪分析技术，但这些方法需要经过漫长的样品制备程序，并且在地理可追溯性方面未能达到足够的准确性水平19.开发了近红外光谱法和 ICP-MS 方法，并结合化学计量学方法确定了智利养殖鲑鱼和挪威鲑鱼之间的区别20.最近，Chang 等人。21发表了一种区分来自挪威和智利的大西洋鲑鱼的 LC-HRMS 方法。需要监测鲑鱼地理来源的真实性，但必须仔细考虑开发和验证基于非靶向的方法所需的来源和样本数量，因为这将对开发的任何程序的稳健性产生巨大影响。

 

鲑鱼的巡航生长模式使其食用品质受到生长环境、饮食和急性应激反应的高度影响22，因此单一的分析方法极不可能提供确保真实性所需的所有信息。快速蒸发电离质谱法 （REIMS） 是一种无需任何样品预处理即可提供实时原位分析的技术，并在一系列食品真伪应用中表现出优异的性能，尤其是在鱼类分析中23,24 元.电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS） 被认为是进行元素分析的首选仪器平台，它已被证明是食品真伪检测的强大技术，已被用于确定大米等各种食品的地理来源25茶26和蜂蜜27.

 

最近的研究表明，数据融合结合化学计量学方法可以有效地评估和分类食品的质量，表明数据融合-多元统计分析在食品真伪研究中具有巨大潜力28,29,30 元.Robert 等人。31研究了拉曼光谱和红外光谱结合数据融合策略评估红肉质量的预测能力。Ottavian 等人进行的一项研究。32证实了可以有效利用数据融合策略来提高新鲜和冻融鱼区分的分类准确性。然而，之前尚未对 ICP-MS 和 REIMS 联合使用数据融合和多变量分析方法来验证鲑鱼来源和生产方法进行研究。

 

本研究的重点是确定如何最好地根据地理来源确定鲑鱼的真实性，并区分野生和养殖来源。采用两种不同的质谱平台进行脂质组学和元素组学方法，生成的数据经过先进的化学计量学建模和机器学习。

 

从四个地区（阿拉斯加、挪威、冰岛和苏格兰）和两种生产方法（养殖和野生捕捞）收集了大量 （n = 522） 已知来源的鲑鱼样本。对这些进行分析，以根据其脂质和元素谱识别和表征生物标志物，这些生物标志物可用于验证鲑鱼的来源和生产方法。基于中级数据融合的多变量数据分析方法用于演示如何使用该技术提供一种准确的、基于科学的方法来验证鲑鱼的可追溯性。使用从许多英国超市购买的 17 个鲑鱼样品来评估该方法的稳定性和可信度。

 

结果

用于鲑鱼分析的 REIMS 数据分析

为了探索识别特定鲑鱼生长区域的能力，采用主化合物分析 （PCA） 作为线性无监督特征提取方法，以降低 REIMS 数据的维度。所得光谱数据在进行 PCA 之前进行了预处理。结果如图 2 所示。1a，展示了研究中包括的四个地区（阿拉斯加、挪威、冰岛和苏格兰）之间的相对差异。使用载荷图来揭示 PCA 中的各个主成分组成（图 D）。1b）. 加载函数（图 D）。1c） 显示单个质谱峰对第二主成分 （PC2） 的贡献。加载图峰对应于脂肪酸（包括不饱和脂肪酸和支链脂肪酸）、甘油二酯磷酸甘油二酯 （GP0401）、甘油二酯磷酸胆碱 （GP0101） 和三十烷基甘油 （GL0301） 物质，使用 LipidMaps 数据库进行初步鉴定33.

 

图 1：阿拉斯加鲑鱼、冰岛鲑鱼、挪威鲑鱼和苏格兰鲑鱼的 REIMS 脂质组指纹图谱揭示了各类之间的明显差异。

图 1

阿拉斯加鲑鱼、冰岛鲑鱼、挪威鲑鱼和苏格兰鲑鱼之间的 PCA 得分图：在冰岛组的 PCA 模型中观察到组内差异（浅蓝色点）。为清楚起见，显示了 PC1 和 PC3。PC1 贡献了 38.37% 的解释变体，PC3 贡献了 15.26% 的解释变体总数。b 4 个鲑鱼组之间的 PC1 和 PC3 加载图。c 4 个鲑鱼组的 PC2 加载图，在解释的总变异中贡献了 24.0%。d 冰岛养殖鲑鱼和冰岛野生鲑鱼之间的 PCA 评分图。e 冰岛野生鲑鱼和养殖鲑鱼之间的 PC1 和 PC2 加载地。

 

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冰岛鲑鱼组在 PCA 图中被清楚地分为两个部分（图 D）。1a）. 其中 1 个样本涉及 90 个野生捕捞的鲑鱼样本，其余 50 个样本来自养殖来源。化学计量学模型（图 D）。1d） 的创建是为了将来自冰岛的鲑鱼样本分类为“野生鲑鱼”或“养殖鲑鱼”，PCA 评分图清楚地显示了这两个鲑鱼组之间的显着差异。PCA 模型的 CV-方差分析结果表明，冰岛养殖鲑鱼组和野生鲑鱼组之间存在显着差异 （p < 0.001）。图 1e 显示了 PC1 和 PC2 之间的加载图，它再次清楚地显示了所有五组之间的差异，所有鲑鱼样品组的质谱也是如此（补充图S 1）。

 

然后进行监督建模，利用正交偏最小二乘法 - 判别分析 （OPLS-DA）、偏最小二乘法 - 判别分析 （PLS-DA） 和主成分分析 - 线性判别分析 （PCA-LDA） 建模。这是为了识别每个鲑鱼组之间离子强度变化最大的单个化学标志物。冰岛野生鲑鱼和养殖鲑鱼组的 OPLS-DA（补充图S 2）模型显示了两类鲑鱼之间最明显的差异，并用于生物标志物的选择和鉴定。通过将一组与其余四组进行比较来生成多个 S 图，以确定每个单独组独有的化学标志物。这又重复了四次，直到每组与其余组的组合进行单独分析，从而生成五个 S 图（补充图S 3）。

 

如表 1 所示，总共 18 种候选生物标志物的离子强度变化能够区分 5 个鲑鱼组。然而，鲑鱼来源的鉴定不能仅基于这些生物标志物（补充图S 6），因为特征数量太少，无法获得高精度。MS 扫描数据用于初步鉴定生物标志物，最初根据 Schymanski 等人提出的 HRMS 化合物鉴定系统 Tier 1-4 进行鉴定。34，然后将其与 LipidMaps 数据库中的脂质组进行比较33.这些生物标志物被初步鉴定为属于不饱和脂肪酸、伯酰胺、支链脂肪酸、N-酰基胺、二酰基甘油磷酸甘油、二酰基甘油磷酸胆碱和三酰基甘油的脂质基团。由于这项工作的目标不是研究 C=C 键的位置或检测到的 FA 是否存在链支化，因此没有进一步确定碳-碳 pi 键的位置。

 

表 1 化学计量模型中已鉴定的生物标志物和发现对分离来自不同地理来源的鲑鱼最重要的离子的推定鉴定

全尺寸表格

在 18 种生物标志物脂质中，发现 8 种（FA 15：1、FA 18：3、FA 20：5、FA 22：6、FA 22：1、FA 18：2、FA 18：1、NA 7：0）是至少三个鲑鱼组的代表性生物标志物（补充表 S1），例如，质量柱 327.3 包含在所有五个鲑鱼组中发现的生物标志物，可用于根据该化合物的强度区分这些组。由于这八种脂质在鲑鱼中很常见，因此分别评估了它们在五个鲑鱼组中的相对含量（图 D）。鲑鱼组之间的脂肪酸谱显示出差异，当将养殖组（挪威、苏格兰和冰岛）与野生组（阿拉斯加和冰岛）进行比较时，后者表现出更高水平的促进健康的 omega-3 脂肪酸：DHA （FA 22：6）、EPA （FA 20：5） 和 FA 22：1，但 ALA 水平较低 （FA 18：3）。挪威鲑鱼、苏格兰鲑鱼和冰岛养殖鲑鱼中的支链脂肪酸（FA 18：1、FA 18：2、FA 18：3）的含量高于阿拉斯加鲑鱼和冰岛野生鲑鱼。发现的观察到的差异很可能是由于野生捕捞鲑鱼和养殖鲑鱼的饮食差异。据报道，从大豆、亚麻和油菜种子中获得的鲑鱼饲料中油的使用增加，富含 FA，如 18：1、18：2 和 18：3，浓度 FA 18：2 和 18：3 在养殖鲑鱼中更为丰富18，这与本研究中生成的数据一致。

 

图 2：脂质差异对鲑鱼地理识别的主要影响。

图 2

a 阿拉斯加鲑鱼、冰岛养殖鲑鱼、冰岛野生鲑鱼、挪威鲑鱼和苏格兰鲑鱼的脂质生物标志物直方图。b 从五个鲑鱼组获得的 REIMS 光谱数据 （m/z 200–1200） 的 PCA 评分图和 c LDA 图。有关五组的质谱指纹图谱，请参见补充图 3。S1 的

 

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挪威，世界上最大的养殖大西洋鲑鱼生产国35，在其养殖鲑鱼中 FA 18：1、18：2 和 18：3 的相对含量最高，而在不饱和脂肪酸含量方面，挪威鲑鱼也表现良好。有趣的是，继阿拉斯加鲑鱼之后，挪威养殖鲑鱼在 FA 15：1 中达到了五个组中第二高的相对含量，这可能是由于对鲑鱼饲料成分的研究越来越关注36.鲑鱼饮食已被证明对肌肉脂质和脂肪酸组成以及生长性能有直接影响37,38 元.Giuseppina 等人。18表明，对鲑鱼采用的水产养殖做法的国际标准化可以消除归因于地理位置的 FA 级别的差异。因此，脂质组学和元素组学分析的结合更有可能成为确定鲑鱼来源的可靠和可靠的方法。

 

The PCA score plot shows the chemical compounds of each sample group. R2 and Q2值分别为 0.957 和 0.93，表明 PCA 模型既稳健又对其他数据点具有良好的预测能力。PCA-LDA 建模以前已被证明在 REIMS 数据中表现良好39.因此，使用参考数据库构建了 LDA 模型，该数据库由质谱填充，该质谱具有鲑鱼来源鉴别的鱼脂质类型，然后使用留 20%-out 交叉验证对模型进行评估。PCA-LDA（图2c） 模型显示阿拉斯加鲑鱼、冰岛养殖鲑鱼、冰岛野生鲑鱼、挪威鲑鱼和苏格兰鲑鱼之间的分离更加明显。

 

证明了 REIMS 在鲑鱼来源快速分析中的应用，在本研究中首次成功获得了来自 5 个不同来源和 2 种生产方法的鲑鱼的脂质指纹。在总共 5500 个 HRMS 成分中，有 8 种脂质被鉴定为代表性生物标志物。使用 LDA 模型时，省略 20% 的交叉验证为鲑鱼样品提供了 100% 的鉴定准确率（补充表 S2）。

 

该模型用于确定从许多英国超市购买的鲑鱼的来源 （n = 17）。在三个测试样本中发现了潜在的异常值（补充表 S2 和 S6）。这些异常值是苏格兰养殖的鲑鱼样本。与零售供应商核对了三个外围结果，并确认了每个结果的完全可追溯性，从而表明发生了分析错误而不是贴错标签，本研究的总体正确识别成功率为 82.4%。

 

鲑鱼的元素组成区分来自一系列地理来源

使用 ICP-MS 建立了用于以下元素分析的筛选方法：Li、Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、S、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Rb、Sr、Y、Nb、Mo、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Cs、Ba、Tb、Ho、Ta、W、Re、Hg、Tl、 对数据进行 Pb、Bi、U. PCA 和分层聚类分析，以获得不同来源样品的鲑鱼的总体元素差异（数据分为五组：阿拉斯加鲑鱼、冰岛养殖鲑鱼、冰岛野生鲑鱼、挪威鲑鱼和苏格兰鲑鱼）。PCA 分数图显示了每组的元素分布，表示五组之间的元素差异（图 D）。3a）. R 的值2X 和 Q2，分别获得了 0.98 和 0.85，从而表明 PCA 模型既稳健又稳定。OPLS-DA 用作监督模型来评估来自 ICP-MS 平台的数据（图 D）。结果显示，五组之间有很好的分离。OPLS-DA 生成了所有单元组件 R2X = 1，R2Y = 0.76，Q2（暨） = 0.74。这强烈表明 OPLS-DA 模型具有很强的解释样本差异的能力，并展示了鲑鱼中元素的分布在五个样本组之间是如何变化的。